Question biologie 3 - Les utilisations de la GFP

marieb148 a écrit:il peut aussi servir de marqueur de transfection, afin de vérifier que la construction est bien "entrée" dans les cellules

Si je peux nuancer, je rajouterais que c'est surtout le fait que le gène de la GFP s'exprime et pas seulement qu'il soit présent. En effet, il peut s'insérer dans l'hôte sans être transcrit pour autant... S'il s'exprime, on est sûr qu'il s'est inséré dans le génome du receveur.

Ben avec le Calcium, justement, ce n'est pas la même technique... !

Loic a écrit:

marieb148 a écrit:il peut aussi servir de marqueur de transfection, afin de vérifier que la construction est bien "entrée" dans les cellules

Si je peux nuancer, je rajouterais que c'est surtout le fait que le gène de la GFP s'exprime et pas seulement qu'il soit présent. En effet, il peut s'insérer dans l'hôte sans être transcrit pour autant... S'il s'exprime, on est sûr qu'il s'est inséré dans le génome du receveur.

Perso je l'utilisais en co transfection, exprimé sour un promoteur ubiquitaire docn si tu bosses en bactério pas besoin d'insertion dans le génome pour que ca s'exprime...

Sinon pour ce qui est du fret, honte sur moi... La thésarde dans mon labo (à Lille) en faisait.... je suis minable sur ce coup là je dois pouvoir trouver des articles...

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15922298ordinalpos=3&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum

voilà, c'est l'article qu'elle a publié mais je n'ai accès qu'à l'abstract....

Sinon il suffit de taper FRET dans pubmed ou sur le site des plos pour avoir un max d'exemples récents.

L'article "fondateur" concernant la localisations du Ca2+ dans les différents compartiments cellulaires est celui-ci :
http://www.nature.com/nature/journal/v388/n6645/abs/388882a0.html

Je peux l'avoir aussi... Mais il me faut un délai

Depuis la technique a été déclinée (en terme de prot fluo couplées) et étendue à d'autres molécules d'intérêt à localiser.

OK c'est bon ! Alors qui fait un résumé ???

Simplement, la GFP, on s'en sert pour quoi, et comment ?

1. construction génique => repérer la localisation de l'expression d'un gène

2. associé à d'autres molécules => s'associe à Ca2+ => fluorescence => localisation du Ca2+ notamment lors de la contraction musculaire, ou au niveau synaptique.

Vous avez bien bossé... Vous aurez droit à un bonbon (comme les collégiens par la CPE... Mdr, elle dit que c'est pas éthique mais que ça marche ! Lol, du coup, moi, j'en profite aussi ) !

A bientôt pour une nouvelle question !!! (va falloir que je songe à en faire en géol...)

Cattina a écrit:
1. construction génique => repérer la localisation de l'expression d'un gène

2. associé à d'autres molécules => s'associe à Ca2+ => fluorescence => localisation du Ca2+ notamment lors de la contraction musculaire, ou au niveau synaptique.

Qu'est ce que tu entends par construction génique ?

Parce que dans le cas du FRET permettant de faire de la localisation ionique (ou autre...) pour moi c'est aussi de la construction génique.

Le principe est toujours de construire un plasmide qui va s'exprimer dans les cellules transfectées -> expression d'une protéine de fusion ayant les propriétés recherchées.

Tu veux dire que pour montrer la localisation du Ca2+ dans le muscle, on fait aussi un plasmide et tout ??? Ben merde alors, j'ai pas appris ça moi, je pensais qu'on mettait juste GFP (genre en solution) (d'ailleurs pour moi, on l'appellait aussi aequorine, du nom de la méduse !! ) et que ça suffisait... Va falloir que je cherche alors... :star: (je viens de voir ce petit smiley...)

Ah bah non je pense pas qu'il suffise de mettre en solution et paf !

Déjà la GFP toute seule c'est gros, alors là on lui colle un polypeptide spécial la liant à une seconde protéine => c'est la misère à faire rentrer un truc pareil !!

Et de toute manière, ton complexe prot-prot, il faut bien le fabriquer puisque qu'il n'existe pas à l'état naturel. Donc il faudrait le faire produire en système bactérien ou levure (donc à partir d'un plasmide) puis le purifier (alors là je t'explique pas l'horreur) puis le transfecter dans les cellules (sur des neurones tu oublies tout de suite...)

Je suis sûr qui si tu vas sur les sites des grandes compagnies commerciales tu trouve des plasmides tout prêts, ya plus qu'à les acheter !!

Davidus a écrit:
Je suis sûr qui si tu vas sur les sites des grandes compagnies commerciales tu trouve des plasmides tout prêts, ya plus qu'à les acheter !!

Ah parlé trop vite a priori

Il semble qu'il faille acheter chaque vecteur indépendament et se faire sa petite construction (ou la piquer dans le labo d'en dessous )

Ah, j'ai pas rêvé et mon prof ne disait pas n'importe quoi !!! Ouf... (et j'aime bien avoir raison looool, nan, je plaisante, j'aime bien apprendre des trucs... ! )

"Dès 1963, Shimomura et al., montraient que l’on pouvait mesurer des microquantités de calcium avec une solution d’aequorine (Shimomura et al., 1963). Très rapidement à la suite de ces travaux, l’aequorine a excité l’intérêt des physiologistes essayant de traquer le calcium.
La première utilisation de l’aequorine dans les cellules vivantes, a été publié en 1967 par Ridgway & Ashley. Après micro-injection de l’aequorine, ils ont quantifié des variations de la concentration en Ca2+ lors de la contraction de la fibre musculaire de balane. Par la suite, toujours après micro-injection, on a pu mettre en évidence les variations de calcium par exemple dans les myocytes, les neurones ou au cours méiose ovocytaire (Moreau et al. 1978, 1980) et de la fécondation (Ridgway et al.,1977, Leclerc et al. 2000a)."

Donc on peut le faire mais peut être que ça ne se fait plus...

Ah ben tapé trop vite

La suite du doc...

"Dans les années 90, l’aequorine recombinante est devenue un outil de choix pour étudier les variations de calcium tant dans le cellules animales que végétales (Mazars et al, 1997, Pauly et al., 2000) et au niveau subcellulaire.
Avec l’aequorine recombinante, il n’y a plus besoin de microinjection, ou de passage par les micropipettes de patch clamp ou des chocs osmotiques ou de traitements à l’ATP pour induire la perméabilisation des cellules. On a pu adresser cette sonde calcique à des organites ou à des compartiments subcellulaires précis. Dans ces conditions le signal lumineux émis provient d’un compartiment cellulaire bien caractérisé. On peut ainsi suivre l’homéostasie calcique dans des organelles spécifiques de cellules vivantes."

OK, par µ-injection (mais pas juste en solution, même il y a 40ans :tongue:) mais c'est laborieux comme technique et ce n'est plus utilisé que dans certains cas particulier.

Mais alors, car moi j'ai toujours une question au fond de ma poche, comment en 1963 puis 67 ils sont mis en évidence le Ca2+ ? Car là pas question de FRET...

Est-ce que tu aurais les refs exactes ??

Merci !

Ben t'as les noms des auteurs dans ce que je donne...

Mais t'embête pas avec ça va... C'est un micro détail...

On y a passé assez de temps !!! Non ?

Ah ben apparemment y'a plus récent que ça...

http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=7883344

Sinon, je comprends pas ta question du fond de ta poche ??? Il savaient que aequorine est fluorescente quand elle est en contact avec Ca2+ donc quand fluorescence => Ca2+ ! Où est le pb ???

OK, je ne savais pas que aequorine n'est fluo qu'en présence de Ca2+....

C'est trop vieux pour moi toutes ces manips, j'en était resté à des trucs récents de transfert de fluorescence. A priori on voit la même chose, c'est juste plus compliqué à mettre en place

Vi, allors donc c'est aussi pour ça que je voulais le dire ===> ça fera TRES bonne impression et encore plus cette année si vous pouvez caser le prix Nobel, dans un devoir sur Ca2+ !!

On boucle le sujet ?

Bon, OK, je suis en train de démêler un peu tout ça

En fait il se produit un FRET naturel in vivo chez la méduse, entre le complexe [aequorine/3Ca2+] et la GFP. L'aequorine n'est donc pas la GFP. Et c'est ce point que je n'avais pas pigé qui m'embrouillais depuis 2 pages... Et je pense ne pas être le seul

L'aequorine n'est pas stable et ne produit pas un signal très intense. Elle n'est donc utilisé QUE pour les études calciques. D'où le développement et le succès de la GFP pour toutes les autres applications.

Donc Nobel pour la GFP attention si utilisé dans une copie, pas de confusion comme je viens de le faire

Rappel des noms des lauréats :
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien

Oui on peut boucler le sujet

PS Cattina : quand j'ai commencé je ne lache JAMAIS une question tant que je ne suis pas sûr d'avoir compris...
:lourd:

Mdr, mince, j'avais écris... et comme t'as posté en même temps...

Non, tu as raison, et j'avais bien remarqué... Moi, c'est pour toi, je suis ok, mais j'ai l'impression que tu t'attadres des fois très (trop) longtemps sur des choses ok passionnantes, je te l'accorde, mais peut être pas indispensable pour le concours, nan ? Enfin, tu fais comme tu veux...

Et t'es pas le seul à t'être embrouillé en effet... J'avais fait gaffe au début et plus après

Bon moi, au dodo... Bonne nuit :sleep: