immunuflorescence

Bonjour à tous,
J ai un soucis avec la technque d immunofluorescence.
On detecte les cellule béta du pancréas grâce à une technique d' immunofluorescence indirecte.
J 'en déduis que les anticorps se fixent à l'insuline dans le cytoplasme des cellules ( il n' y a pas d' insuline membranaire).
Comment est ce possible?

Bonne question... [à une conf, un conférencier avait dit "c'est généralement ce qu'on dit quand on ne connait pas la réponse"... ]

Pour ma part, mais à confirmer, j'ai cherché rapidement mais pas trouvé..., je pense que les Ac se dixent à l'insuline sécrétée, mais ça me semble bizarre étant donné que c'est sécrété dans les capillaires...

A chercher...

peut-être qu'elle détecte la prépro-insuline qui est vésiculaire et fixée me semble-t-il à la membrane côté lumen (lumen?? ) de la vésicule de golgi ????

mais quand la technique est indirecte, l'anticorps se fixe sur un autre Ac ou une autre protéine spécifique de celle que l'on détecte

ah, mince, j'avais lu "directe", trop rapidement...

nicolas a écrit:Bonjour à tous,
J ai un soucis avec la technque d immunofluorescence.
On detecte les cellule béta du pancréas grâce à une technique d' immunofluorescence indirecte.
J 'en déduis que les anticorps se fixent à l'insuline dans le cytoplasme des cellules ( il n' y a pas d' insuline membranaire).
Comment est ce possible?

Quand on cherche à typer des cellules ou à détecter un certain type cellulaire dans une pop, on cible généralement des récepteur membranaires spécifiquement exprimés par les cellules d'intérêt. Je ne connais pas le cas particulier des cellules pancréatique beta, mais il faut peut-être plutot chercher de ce coté que du coté de la détection intracellulaire de l'insuline ?

Non, David, je ne suis pas d'accord, parceque ce qu'on cherche ce ne sont pas les cellules béta, mais les cellules qui produisent l'insuline (enfin, je pense, c'est vrai que ça n'est pas explicite dans la question de Nicolas...), et là, on se rend compte que ce sont les cellules béta... Donc il faut un marqueur de l'insuline...

Et il n'y a pas un récepteur ?

Parce que si on arrive à cibler l'insuline c'est plutôt direct comme méthode. Alors que par un récepteur c'est moins direct non ?

Mais je le répète : je n'ai pas la moindre idée de la manière dont fonctionnent les cellules béta du pancréas

Je ne comprends pas, un récepteur de quoi ?

Ben les cellules bétas du pancrés sont des cellules sécrétrices. Comme l'a dit Manoo, l'insuline est synthétisée sous forme de pro-insuline qui sera activée ensuite en insuline. Et ensuite, c'est sécrété par exocytose des vésicules. Je pense pas qu'il y aie de récepteur, donc...

Elle sont pas régulées ces cellules ?

ben oui pourquoi pas les récepteurs

les cellules B fonctionnent par autocrinie

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VM6-3X5H0K2-2&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=b2ff54395f6859ae6ecc18485bc62ffb

Une piste ?

OK, en fait, je comprends... C'est parceque moi, je suis restée sur l'idée de "on sait que le pancréas produit de l'insuline, on cherche quelles sont les cellules qui le sécrètent, mais on ne sait pas comment elles sont régulées ni rien, donc on cherche l'insuline..." en fait, c'est trop simple, je pense que vous avez raison...

Non, en fait je pense que la piste de la proinsuline est la bonne.

Pour la modique somme de 451€ HT vous avez ceci :
http://www.bioreagents.com/products/productDetails/productDetails.cfm?catnbr=MA1-22710

Oui l'idée est de detecter les cellules béta ( on detecte d' ailleurs aussi les cellules alphaavec des AC anti glucagon ). On présente le document en Première S.

Ce que je ne comprends pas, que ce soit la pré-proinsuline ou la proinsuline , c' est qu' elles sont localisées dans les vésicules.
Donc comment les AC se fixent-ils aux hormones?

On peut marqué le cytosquelette.......donc les AC traversent les membranes. Non?

Ça dépend des Ac et ça dépend des protocoles (et des types cellulaires aussi)

Mais oui, d'une manière générale on peut faire traverser une/des membranes à une protéine. Après, garder la cellules en vie c'est un autre problème

ça m' échappe......comment les Ac se retrouvent ils à l' intérieur de la cellule?

soit grâce à la formation de vésicule d'endocytose, soir parce que la membrane a été temporairement perméabilisée, soit par un mécanisme parfaitement inconnu

Je vais garder la deuxième option .
Merci .

Davidus a écrit:soit grâce à la formation de vésicule d'endocytose, soir parce que la membrane a été temporairement perméabilisée, soit par un mécanisme parfaitement inconnu

on perméabilise les membranes par des courants électriques pour les ions, concernant les Ac comment cela marche-t-il?

la taille d'un Ac est assez conséquente! donc comment s'y prend-on?

comme tu le dis, par électrotransfert (on dit électroporation, car on forme des pores dans les membranes par un choc électrique). C'est très traumatisant pour les pauvres cellules soumises à un tel traitement et 90% trépassent. Ça peut marcher pour de l'ADN et certaines protéines.

Sinon il y a les méthodes chimiques, et l'utilisation de transfectants qui permettent une entrée via une vésicule d'endocytose.

pour l'ADN aussi je savais et ça me choque par c'est mini!!! (en général on fait pas rentrer des fragments balèzes, sauf existence de canaux spéciaux chez certaines bactéries)

mais un Ac! mais si tu me dis que ça fait des pores (ok pour ça y a pas de soucis) je suppose que c'est de taille.

ben pour des pores de cette taille les résultats doivent être très minces