immunuflorescence

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immunuflorescence

Message par nicolas le Sam 6 Déc - 19:43

Bonjour à tous,
J ai un soucis avec la technque d immunofluorescence.
On detecte les cellule béta du pancréas grâce à une technique d' immunofluorescence indirecte.
J 'en déduis que les anticorps se fixent à l'insuline dans le cytoplasme des cellules ( il n' y a pas d' insuline membranaire).
Comment est ce possible?

nicolas
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Re: immunuflorescence

Message par Cattina le Sam 6 Déc - 19:52

Bonne question... [à une conf, un conférencier avait dit "c'est généralement ce qu'on dit quand on ne connait pas la réponse"... Suspect ]

Pour ma part, mais à confirmer, j'ai cherché rapidement mais pas trouvé..., je pense que les Ac se dixent à l'insuline sécrétée, mais ça me semble bizarre étant donné que c'est sécrété dans les capillaires...

A chercher...

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Re: immunuflorescence

Message par Manoo le Sam 6 Déc - 20:01

peut-être qu'elle détecte la prépro-insuline qui est vésiculaire et fixée me semble-t-il à la membrane côté lumen (lumen?? Suspect ) de la vésicule de golgi ????

mais quand la technique est indirecte, l'anticorps se fixe sur un autre Ac ou une autre protéine spécifique de celle que l'on détecte

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Re: immunuflorescence

Message par Cattina le Sam 6 Déc - 20:01

ah, mince, j'avais lu "directe", trop rapidement... Embarassed

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Re: immunuflorescence

Message par Davidus le Sam 6 Déc - 20:47

nicolas a écrit:Bonjour à tous,
J ai un soucis avec la technque d immunofluorescence.
On detecte les cellule béta du pancréas grâce à une technique d' immunofluorescence indirecte.
J 'en déduis que les anticorps se fixent à l'insuline dans le cytoplasme des cellules ( il n' y a pas d' insuline membranaire).
Comment est ce possible?

Quand on cherche à typer des cellules ou à détecter un certain type cellulaire dans une pop, on cible généralement des récepteur membranaires spécifiquement exprimés par les cellules d'intérêt. Je ne connais pas le cas particulier des cellules pancréatique beta, mais il faut peut-être plutot chercher de ce coté que du coté de la détection intracellulaire de l'insuline ?

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Re: immunuflorescence

Message par Cattina le Sam 6 Déc - 20:53

Non, David, je ne suis pas d'accord, parceque ce qu'on cherche ce ne sont pas les cellules béta, mais les cellules qui produisent l'insuline (enfin, je pense, c'est vrai que ça n'est pas explicite dans la question de Nicolas...), et là, on se rend compte que ce sont les cellules béta... Donc il faut un marqueur de l'insuline...

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Re: immunuflorescence

Message par Davidus le Sam 6 Déc - 20:58

Et il n'y a pas un récepteur ?

Parce que si on arrive à cibler l'insuline c'est plutôt direct comme méthode. Alors que par un récepteur c'est moins direct non ?

Mais je le répète : je n'ai pas la moindre idée de la manière dont fonctionnent les cellules béta du pancréas Embarassed

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Re: immunuflorescence

Message par Cattina le Sam 6 Déc - 21:00

Je ne comprends pas, un récepteur de quoi ?

Ben les cellules bétas du pancrés sont des cellules sécrétrices. Comme l'a dit Manoo, l'insuline est synthétisée sous forme de pro-insuline qui sera activée ensuite en insuline. Et ensuite, c'est sécrété par exocytose des vésicules. Je pense pas qu'il y aie de récepteur, donc...

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Re: immunuflorescence

Message par Davidus le Sam 6 Déc - 21:01

Elle sont pas régulées ces cellules ?

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Re: immunuflorescence

Message par Manoo le Sam 6 Déc - 21:01

ben oui pourquoi pas les récepteurs

les cellules B fonctionnent par autocrinie

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Re: immunuflorescence

Message par Cattina le Sam 6 Déc - 21:04

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VM6-3X5H0K2-2&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=b2ff54395f6859ae6ecc18485bc62ffb

Une piste ?

OK, en fait, je comprends... C'est parceque moi, je suis restée sur l'idée de "on sait que le pancréas produit de l'insuline, on cherche quelles sont les cellules qui le sécrètent, mais on ne sait pas comment elles sont régulées ni rien, donc on cherche l'insuline..." en fait, c'est trop simple, je pense que vous avez raison...

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Re: immunuflorescence

Message par Davidus le Sam 6 Déc - 21:09

Non, en fait je pense que la piste de la proinsuline est la bonne.

Pour la modique somme de 451€ HT vous avez ceci :
http://www.bioreagents.com/products/productDetails/productDetails.cfm?catnbr=MA1-22710

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Re: immunuflorescence

Message par nicolas le Sam 6 Déc - 22:26

Oui l'idée est de detecter les cellules béta ( on detecte d' ailleurs aussi les cellules alphaavec des AC anti glucagon ). On présente le document en Première S.

Ce que je ne comprends pas, que ce soit la pré-proinsuline ou la proinsuline , c' est qu' elles sont localisées dans les vésicules.
Donc comment les AC se fixent-ils aux hormones?

nicolas
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Re: immunuflorescence

Message par nicolas le Sam 6 Déc - 22:44

J' avais trouvé ce protocole :
Exemple du diabète où les îlots de Langerhans peuvent être reconnus par les anticorps anti-îlots de Langerhans des patients:

congélation dana l'azote liquide d’un pancréas de rat ;
coupes de 5 µm d'épaisseur, à -30°C, avec un cryomicrotome : ceci préserve les antigènes qui ne sont pas abîmés ;
fixation des coupes sur les lames de verre du cryomicrotome par le simple passage de - 30°C à +20°C qui équivaut à une séchage rapide ;
délimitation d’un cercle hydrophobe autour du tissu avec de la graisse de silicone afin d’éviter la perte de réactif ;
ajout du sérum du patient, incubation, puis 3 lavages à tampon salin pendant 5 min qui éliminent les anticorps non fixés aux antigènes du tissu pancréatique ;
ajout d’anticorps marqués (sérum animal) anti-immunoglobulines humaines ;
lavages ;
observation au microscope à UV ;
résultats : les îlots de Langerhans apparaissent brillants.
.
Cette technique peut aussi utilisée avec des anticorps directement conjugués, dans une méthode directe, pour visualiser ou rechercher par exemple :
l'actine du cytosquelette dans des cellules ou des tissus;
HIV sur les membranes cellulaires de cellules isolées ou de tissus;
les complexes immuns constitués d'anticorps anti-ADN et d'ADN déposés le long des membranes basales cutanées du Lupus Erythémateux Disséminé. Dans ce cas, les anticorps marquée anti-immunoglobulines humaines sont déposés sur des coupes à la congélation d'une biopsie de la peau du malade.

nicolas
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Re: immunuflorescence

Message par nicolas le Sam 6 Déc - 22:46

On peut marqué le cytosquelette.......donc les AC traversent les membranes. Non?

nicolas
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Re: immunuflorescence

Message par Davidus le Sam 6 Déc - 23:41

Ça dépend des Ac et ça dépend des protocoles (et des types cellulaires aussi)

Mais oui, d'une manière générale on peut faire traverser une/des membranes à une protéine. Après, garder la cellules en vie c'est un autre problème Wink

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Re: immunuflorescence

Message par nicolas le Dim 7 Déc - 10:30

ça m' échappe......comment les Ac se retrouvent ils à l' intérieur de la cellule?

nicolas
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Re: immunuflorescence

Message par Davidus le Dim 7 Déc - 12:30

soit grâce à la formation de vésicule d'endocytose, soir parce que la membrane a été temporairement perméabilisée, soit par un mécanisme parfaitement inconnu Laughing

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Re: immunuflorescence

Message par nicolas le Dim 7 Déc - 12:35

Je vais garder la deuxième option .
Merci .

nicolas
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Re: immunuflorescence

Message par Manoo le Jeu 11 Déc - 16:42

Davidus a écrit:soit grâce à la formation de vésicule d'endocytose, soir parce que la membrane a été temporairement perméabilisée, soit par un mécanisme parfaitement inconnu Laughing

on perméabilise les membranes par des courants électriques pour les ions, concernant les Ac comment cela marche-t-il?

la taille d'un Ac est assez conséquente! donc comment s'y prend-on?

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Re: immunuflorescence

Message par Davidus le Jeu 11 Déc - 17:02

comme tu le dis, par électrotransfert (on dit électroporation, car on forme des pores dans les membranes par un choc électrique). C'est très traumatisant pour les pauvres cellules soumises à un tel traitement et 90% trépassent. Ça peut marcher pour de l'ADN et certaines protéines.

Sinon il y a les méthodes chimiques, et l'utilisation de transfectants qui permettent une entrée via une vésicule d'endocytose.

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Re: immunuflorescence

Message par Manoo le Jeu 11 Déc - 17:07

pour l'ADN aussi je savais et ça me choque par c'est mini!!! (en général on fait pas rentrer des fragments balèzes, sauf existence de canaux spéciaux chez certaines bactéries)

mais un Ac! mais si tu me dis que ça fait des pores (ok pour ça y a pas de soucis) je suppose que c'est de taille.

ben pour des pores de cette taille les résultats doivent être très minces

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